高产虫草菌素蛹虫草菌株的紫外线诱变选育

蛹虫草(Cordyceps militaris (L.) Link)，又名北虫草，是一种重要的药用真菌，已被列入中国药典。在日本、韩国、中国等国家，北冬虫夏草已作为冬虫夏草的替代品，应用于医药和保健食品的开发。目前，北冬虫夏草虽已实现人工栽培，但由于该菌株在人工培养基上易失去形成子实体的能力，影响了北虫草的大规模人工栽培。蛹虫草的无性菌丝体也含有与有性子实体相同的生理活性物质和相似的药用价值。因此，可以利用发酵生产蛹虫草无性菌丝体的方法进行相关产品的开发。但仍面临野生株虫草素等生理活性物质含量低的问题。因此，开展育种工作以提高蛹虫草无性菌丝体中生理活性物质的含量是十分必要的。现将原生质体紫外诱变筛选虫草素高产菌株的结果报道如下。 1 材料与方法1.1 菌株及培养基蛹虫草菌株CM9-26：由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供，作为紫外诱变的起始菌株。菌丝生长和孢子形成培养基：富集PDA培养基（黄庆荣，2005）：马铃薯2009，麸皮50g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04 3g，MgSO4 2.5g，维生素B1 0.01g，琼脂20g，水1000mL 原生质体再生培养基：PDA含0.6mol/L蔗糖的培养基；固体发酵培养基：大米25g，玉米粉0.4g，葡萄糖10g，蛋白胨59；营养液：硫酸镁1.09，磷酸二氢钾29，柠檬酸铵1g，水1000mL。 1:1.6 添加营养液。 1.2 药品、试剂和仪器Alhec h 高压液相色谱仪：美国AUtech公司；纤维素酶(来自Trichoderma Viride)购自Solarbio公司(日本)；虫草素和腺苷标准样品购自Sigma 公司（美国）；大米：市售；其余试剂均为国产分析纯。裂解酶液：以O.8mol/L MgSO4为渗透压稳定剂，配制含1%纤维素酶的酶解液，制备原生质体。 1.3 原生质体的制备与再生菌株CM9-26在PDA培养基上于25恒温培养7-10天，收集孢子，制备成均匀的孢子悬液（1118/mL）。取200uL涂有玻璃纸的PDA板，25孵育65h，收集菌丝。取湿菌丝体300mg，加入裂解酶溶液30mL，25、60r/min酶解2h。过滤原生质体体液，取滤液，3200r/min离心10min，弃上清，沉淀重悬于预冷的0.8mol/L MgSO4溶液中，3200r/min离心10min。将原生质体沉淀重悬于0.8mol/L MgSO4 中，终浓度为106/mL。取200ml原生质体液，涂双层再生培养基板（底层为菌丝生长培养基，上层为再生培养基），25培养4-5天。 1.4 原生质体的紫外诱变处理照射前，打开石英紫外灯管预热30分钟。取5mL浓度为106的原生质体液，置于无菌的9cm直径盘中，磁力搅拌，置于距紫外灯30cm处，分别照射0s、10s、30s、50s , 70s, 90s, 110s, 140s, 170s, 200s, 230s , 300s。在黑暗中完成照射过程，并在红光下操作。每次照射，取1 mL 适当稀释，取0.1 mL 涂于原生质体再生板。 25避光孵育50天，计数，绘制紫外线诱变致死曲线。每个处理3个平行。 1.5固体发酵：将野生菌和诱变后筛选的菌种转移到大斜面产孢培养基中，25恒温培养7-10天，用无菌水清洗斜面孢子，制成均匀的孢子悬液终浓度为106 /mL。取孢子悬液2mL接种固体发酵培养基，25培养15天，取出，60烘干，称干重（以下简称发酵菌干重)、蛹虫草腺苷和虫草素的含量(以发酵菌总量占干重的百分比计)。 1.6 遗传稳定性试验将虫草素高产突变株连续传代15代，每代培养8天，每代进行固体发酵，检测虫草素、腺苷含量和虫草素干重的变化。发酵的细菌团，并研究突变菌株。遗传稳定性。未传代的CMM-81 用作对照。

1.7 HPLC检测蛹虫草腺苷和虫草素的样品处理：准确称取60干燥的发酵菌块0.100g，置于10mL带刻度磨El塞试管中，加水，超声震荡30min，用0.45m滤膜过滤后，取1mL滤液加入10mL刻度试管或容量瓶中，加水稀释至10mL。色谱条件：色谱柱，C18反相柱(4.6mmxl50mm，25m)；柱温，50C；流动相，溶解在甲醇中的10mM KH2PO4，双蒸水(8:92)；流速，0.8mL/min；进样体积，20L；测量波长254nm。 2 结果与分析2.1 紫外线照射时间与蛹虫草原生质体致死率的关系为了确定紫外线照射时间与原生质体致死率的关系，分别用紫外线照射0s、10s、30s、50s。70s、90s、110s、130s、150s、170s、190s、210s、250s、300s，铺再生培养基培养，根据再生菌落数绘制原生质体紫外诱变时效曲线（图1）。根据实验需要和诱变后的初步筛选结果，确定诱变的致死率在85%左右，即紫外线照射时间为170s。图1 北虫草生物量紫外诱变照射时间效应曲线2.2 紫外诱变菌株初步筛选以170s为紫外诱变照射时间，分别照射22批次。每批次稀释后，应用再生培养基，分离得到快速再生的菌株。殖民地334

　　2.3　诱变菌株的复筛　将初筛到的7株菌株进行固体发酵，发酵菌质60℃烘干后测定其干重、虫草菌素以及腺苷的含量。结果见表1，初筛获得的7个突变株发酵菌质干重与出发菌株CM9—26无明显差异。有3株突变株即CMM－6、CMM－81、CMM－234发酵产物的腺苷含量高于出发菌株，其中CMM－81的腺苷含量最高，达到0.036%，是出发菌株的2倍。7个突变株发酵产物的虫草菌素含量均高于出发菌株，其中CMM－81虫草菌素含量最高，达到0.437%，是出发菌株的2倍。综合发酵菌质干重、虫草菌素及腺苷含量，复筛得到1株较优良的突变株CMM－81。

　　2.4　突变株CMM－81遗传稳定性　将复筛得到的突变菌株CMM－81连续传代15代，以发酵菌质干重、虫草菌素和腺苷为指标来评价其遗传稳定性。一般认为连续传代10－15代后各项指标相对于未传代菌株的变化率在≤±5%为遗传稳定的菌株。表2显示，CMM－81传代15代后其发酵菌质干重变化很小，最大变化率为0.77%；发酵物中虫草菌素及腺苷含量的变化也不大，变化率分别为O.92%及2.78%。由此表明，CMM－81能稳定合成虫草菌素，具有很好的遗传稳定性。

表1　发酵菌质干重、虫草素及腺苷含量

表2　菌株CMM－81遗传稳定性试验结果